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TAF是否直接影响ISRE依赖性转录

时间:2020-09-29 09:50 来源:www.kangantu.com 作者:康安途海外就医

  为了检查TAF是否直接影响ISRE依赖性转录,我们使用pISRE-TA-Luc进行了记者基因检测,该编码在ISRE的控制下编码荧光素酶(Luc)基因,该基因负责I型IFN刺激。对照和TAF-1 KD细胞之间的萤光素酶活性没有明显变化,表明TAF-1在由ISGF3复合物调节的ISRE依赖性转录中没有直接作用。这似乎与显示的结果相矛盾,ISGmRNA水平在TAF-1 KD细胞中增加了。

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  由于核小体结构,与组蛋白H1与染色质的结合和远端元件对染色质的影响,从瞬时转染的基因和稳定整合的基因中转录的表达方式有所不同。因为TAF-1具有组蛋白伴侣活性,并且是INHAT复合物的主要成分,所以我们假设TAF可能通过染色质结构调节来控制ISG转录。 TAF-Iα和β共有的C末端酸性结构域对于其组蛋白伴侣活性和INHAT活性至关重要。我们为缺乏酸性结构域的TAF-IΔC突变体构建了表达载体,并进行了抢救实验,以检查组蛋白伴侣活性和/或INHAT活性对于TAF-1对ISG转录的影响是否必不可少。

  在TAF-I siRNA表达载体转染的细胞中观察到siRNA靶序列修饰的Flag标记的TAF-Is的表达,并抑制了TAF-I KD增强的ISG转录通过野生型TAF-I而不是TAF-IΔC,表明对组蛋白伴侣活性至关重要的TAF-I的酸性结构域在ISG的调节中起着作用为了检查TAF是否影响内源ISG启动子上的转录复合物形成,我们进行了ChIP分析以测量在有或没有IFN的情况下TAF-1 KD中STAT1,STAT2和Pol II的量。与对照组相比,在IFN刺激后的早期时间点,TAFKD细胞中与ISG启动子结合的STAT1,STAT2和Pol II的水平升高。这些发现表明TAF-I影响ISG启动子上转录复合物的形成,我们预测上述作用是由TAF-I介导的染色质变化引起的。因此,我们使用抗组蛋白H3(H3)和乙酰化组蛋白H3(H3K9 / 14Ac)的抗体进行ChIP分析,已知后者与主动转录的基因有关,其乙酰化水平受启动子调控相关的HATs,例如p300 / CBP和GCN5。

  qRT-PCR分析表明,在有或没有IFN处理的情况下,TAF-1 KD细胞和对照细胞在ISG启动子上的组蛋白H3的量没有显着差异。交流电在没有IFN的情况下,TAFKD细胞中的乙基化组蛋白H3与对照细胞中的H3保持不变,但是在IFN刺激下,TAFKD细胞中的乙酰化组蛋白H3在早期就增加了。由于STAT与HAT相互作用并以IFN依赖性的方式将它们募集到ISG启动子。

  因此TAFKD细胞中乙酰化组蛋白H3的数量增加可能是由于ISG15启动子上的STAT数量增加所致。此外,使用针对接头组蛋白H1.2(H1)的抗体进行的ChIP分析(H1亚型是一种在HeLa细胞中高度表达的组蛋白H1亚型,与体内TAF-1相关),证明了在没有IFN的情况下以及在IFN刺激的早期时间点,TAF-1 KD细胞ISG启动子上的组蛋白H1明显降低。这些结果表明TAF调节了ISG启动子上的组蛋白H1,但在ISG转录中不充当组蛋白H3-H4分子伴侣或INHAT。接下来,我们解决了组蛋白H1是否调节ISG转录的问题。 我们使用组蛋白H1 siRNA表达载体制备了组蛋白H1 KD细胞。 使用该载体,观察到组蛋白H1 KD细胞中组蛋白H1蛋白的残留水平约为对照细胞的25%。 为了检查对ISGs转录诱导的影响,我们测量了组蛋白H1 KD细胞中ISG mRNA的水平。现在taf哪能买到?价格是多少?需要的话可以添加下方的微信二维码。

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(责任编辑:康安途海外就医)

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