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核心组蛋白结合所需的ET与TAF成分和相互的作用

时间:2020-10-09 13:25 来源:www.kangantu.com 作者:康安途海外就医

  由于H3被确定为SET与TAF-Iβ的优选组蛋白底物,我们着手确定SET 与TAF-Iβ参与H3结合的区域。基于人TAF-Iβ与核小体组装蛋白(NAP)家族成员,特别是来自酵母的NAP-1的序列比较,该酵母的三维结构最近已被解决(PDB ID:2AYU),设计了几个TAF-Iβ的缺失突变体。我们设计突变体的特定目标是挑战二聚结构域,酸性C末端尾部和蛋白质中心区域在H3结合中的作用。先前的结构和生化研究强调了NAP1蛋白质中心区域在与组蛋白相互作用中的重要作用。 β-折叠亚结构域是该区域的一部分,在结构上保守,否则在序列和结构上不相关的组蛋白伴侣,并被认为形成了构建有组蛋白结合元件的支架。

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  如方法部分所示,将野生型TAF-Iβ及其突变体表达并纯化为GST标签的蛋白,然后去除GST部分。TAF-Iβ的野生型和突变形式的结构完整性通过圆二色光谱进行了探索。除了覆盖蛋白质残基的多肽外,所有测试的构建体均折叠良好。全长SET /TAF-Iβ的CD光谱表明主要是α-螺旋蛋白。两种主要二级结构的比例在不同的突变体之间差异很大,这取决于每个构建体中是否包含N端α螺旋部分或C端无序区域。应当注意,由于纯化过程中的技术问题,CD并未分析C端酸性链段预期在溶液中完全无序的蛋白质的唯一部分。

  为了测试TAF-Iβ片段对组蛋白H3的结合活性,我们首先对所有带有GST标签的突变体和H3进行了一系列GST下拉实验。所有TAF-Iβ片段都具有与H3相互作用的能力,但多肽TAF-Iβ110-210却被错误折叠和聚集。这些结果表明,尽管蛋白质具有显着负电荷的C端区域,但TAF-Iβ与H3的结合位点主要位于其中心区域内。此外,似乎TAF-Iβ的二聚化对于相互作用不是必需的,因为缺乏完整的N端二聚化结构域的突变体不会结合H3。

  为了评估分离的TAF-Iβ缺失突变体对H3的相对亲和力,我们再次诉诸于基于荧光的滴定实验。所有TAF-Iβ突变体在其序列中具有一个或多个色氨酸残基,其可以用作固有的荧光发色团。结果与下拉测定法一致,进一步支持SET的中心区域在与H3相互作用中的重要性。他们表明,通常,较短的构建体以TAF-Iβ的中央区域为中心,并且缺少N端二聚结构域和/或酸性C端尾部就足以与H3结合并且它们对H3的亲和力与全长蛋白相当。酵母NAP1的同源区域已显示对于与组蛋白的相互作用至关重要,并被称为“蛋白质相互作用域”。除了能够结合H3的突变体的长度外,大多数复合物的Kd值以及从结合曲线推导的化学计量均清楚地表明,TAF-Iβ的二聚化或酸性尾结构域都不是相互作用所必需的的Kd。我们的数据一致与以前关于酵母NAP1 / H3相互作用的1:1化学计量的观察结果。

  接下来,我们试图鉴定组蛋白H3的区域,该区域与它与TAF-Iβ的结合有关。为此,在下拉试验中测试了与GST融合的重组H3尾部结合野生型和TAF-Iβ(76-185)的能力。显示未检测到与H3氨基末端的结合。相反,观察到两种蛋白都与H3的球状结构域结合。这些结果表明,H3N末端尾部与SET相互作用不是必需的。TAF-Iβ。相反,它们表明TAF-Iβ/ H3相互作用的结合决定簇位于H3的球状结构域内,这一发现与先前的研究表明TAF-Iβ与H3的直接结合相矛盾。 N末端尾巴,当尾巴被修饰时会被破坏。两项研究之间的差异可能是由于检测方法和所用H3片段的差异所致。我们用野生型TAF测试了全长天然组蛋白H3 -Iβ及其缺失突变体在我们的结合测定中。我们还使用了全长H3的重组形式,H3的球形部分及其N末端尾巴。在上述研究中,使用固定在色谱柱上的对应于H3残基1–16的短合成肽测试了TAF-Iβ与H3的结合[我们的数据清楚地表明,TAF-Iβ与H3的结合发生了带有天然H3,其经过大量修饰,并带有完整形式的H3及其核心区域的重组形式。另一方面,在下拉分析中使用未修饰的H3尾巴时,结合被取消。因此,H3的氨基末端尾巴或任何修饰(在核心或尾巴中)似乎都不在其与TAF-Iβ的相互作用中起重要作用。那么taf哪能买到?价格是多少?更多详情可咨询下方微信。

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(责任编辑:康安途海外就医)

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