达拉非尼(dabrafenib)与曲美替尼联合使用可提高疗效

　　丝裂原活化蛋白激酶 (MAPK) 通路激活与许多类型的人类癌症有关。在黑色素瘤、结直肠癌、卵巢癌、甲状腺乳头状癌和胆管癌中，组成性激活 MAPK 信号并绕过上游刺激需要的 BRAF 突变发生率很高。在本报告中，我们描述了新型、强效和选择性 BRAF 抑制剂 dabrafenib (达拉非尼)。达拉非尼对 BRAFV600E激酶活性的细胞抑制导致 MEK 和 ERK 磷酸化降低，并通过最初的 G1细胞周期停滞抑制细胞增殖，随后细胞死亡。在 BRAFV600E中含有人黑色素瘤的异种移植模型，口服达拉非尼抑制ERK活化，下调Ki67，上调p27，导致肿瘤生长抑制。然而，正如其他 BRAF 抑制剂所报道的那样，达拉非尼还通过 CRAF (RAF1) 信号传导诱导野生型 BRAF 细胞中的 MAPK 通路激活，这可能解释了用 BRAF 抑制剂治疗的患者中出现的鳞状细胞癌和角化棘皮瘤。在解决这个问题时，我们发现同时施用 BRAF 和 MEK 抑制剂消除了矛盾的 BRAF 抑制剂诱导的细胞中 MAPK 信号传导，减少了大鼠皮肤损伤的发生，并增强了对小鼠模型中人类肿瘤异种移植物生长的抑制作用。

　　BRAF 激活突变已在许多癌症中被确定为过度增殖的致病决定因素。RNA 敲除和 BRAF的复合抑制导致突变 BRAF 肿瘤细胞的细胞周期停滞和死亡，从而减少了 BRAF 抑制剂在治疗活化的 BRAF 驱动的癌症中的临床应用。

　　我们已将达拉非尼定性为一种选择性 RAF 激酶抑制剂，对来自多个物种的全长 BRAF 具有活性。而达拉非尼在体外抑制截短的 CRAF 激酶，这不会转化为细胞培养，因为具有 CRAF 依赖性 MEK 激活（MEK 抑制剂敏感）的细胞系对达拉非尼不敏感。酶和细胞数据之间存在这种差异的原因尚不清楚，但可能是由于截断（酶测定）与全长（细胞）CRAF 相比，抑制剂敏感性更高。或者，可能存在修饰 CRAF 构象的细胞因子，阻止其与达拉非尼结合。我们也不能排除细胞补偿机制的可能性，或上述所有因素的组合。我们展示了 dabrafenib 对 80% 的 BRAFV600E细胞系的高选择性测试，并假设对 3 个 BRAFV600E相对缺乏活性 (gIC50>2 μM)细胞系可能是由于内部测序证实存在其他突变（GCT 细胞中的 PTEN、RKO 细胞中的 PI3K 和 A673 细胞中的 p53）。本研究中使用的这些和其他细胞系的完整测序数据可以在 NCI 的癌症基因组工作台 (CGWB) 门户网站上找到。能够驱动细胞生长/存活的蛋白质的过表达，或外排泵的上调也可以用于拯救细胞生长免受达拉非尼抑制。虽然对达拉非尼敏感的 BRAFV600E细胞系偶尔也会编码其他突变，但我们认为 BRAFV600E是这些细胞中的关键致癌驱动因素。我们证明了达拉非尼对活化的 BRAFV600K也有活性和 BRAFV600D在酶和细胞水平上的突变体。最近的临床观察支持这一点，其中 BRAFV600D/E/K肿瘤患者对 GSK2118436（达拉非尼）治疗有反应。我们还观察到18 个缺乏 BRAF 激活突变并含有野生型 RAS 的细胞系对 dabrafenib 的轻微敏感性（gIC50从 263 nM 到 6.9 μM）。虽然在这些细胞系之间没有发现共同的突变，但我们推测上游 BRAF 驱动程序的激活突变或过表达可能导致 BRAF 依赖性细胞增殖。此外，虽然 dabrafenib 具有很强的选择性，但我们不能排除可能导致对达拉非尼敏感的脱靶效应。

　　达拉非尼（dabrafenib）对含有活化的突变型 BRAF 的细胞显示出特异性活性。在 BRAFV600E细胞中，达拉非尼以浓度依赖性方式抑制 MEK 和 ERK 活化，具有相似的低 nM 活性。我们证实，在 BRAFV600E细胞系 (A375P) 中，ARAF 或 CRAF 敲低对 MAPK 激活没有影响。然而，dabrafenib 抑制 pMEK 和 pERK 的方式与 BRAF 消耗引起的相似，证实了 dabrafenib 的靶向机制，因为 MAPK 激活在 BRAF V600E细胞中是 BRAF 依赖性的。令人惊讶的是，ARAF 或 CRAF 消耗减少了 dabrafenib 对 MAPK 的抑制，这表明 ARAF 或 CRAF 缺失可能会增加高活性 BRAFV600E的形成同二聚体，以及更少的 ARAF/BRAFV600E或 CRAF/BRAFV600E异二聚体。或者，ARAF 或 CRAF 耗尽可能会导致负反馈回路的放松。在泳道 4 和 7 中使用 BRAF siRNA 观察到略低水平的 MEK 和 ERK，但在泳道 2 中未观察到单独的达拉非尼，尽管它能够诱导细胞死亡。然而，细胞仅暴露于 dabrafenib 1 小时，这不足以通过细胞凋亡减少完整的蛋白质含量，而 siRNA 处理则为 72 小时。总之，这些数据清楚地支持了达拉非尼对癌细胞中活化突变 BRAF 的特异性细胞选择性。

　　在人 BRAFV600E肿瘤异种移植模型中证实了达拉非尼的体内药效学标志物调节和肿瘤生长抑制。当循环达拉非尼浓度低于细胞培养中抑制所需的浓度时，ERK 抑制是快速的（给药后 2 小时）并且有时会令人惊讶地持续（第 7 天和第 14 天给药后 18 小时）。这不能通过药物的肿瘤积累来解释（数据未显示），但可能归因于循环活性达拉非尼代谢物的存在。MAPK 信号传导的体内抑制与肿瘤细胞生长减少相关，并且在持续药物暴露时观察到剂量依赖性肿瘤消退，支持达拉非尼的靶向机制。

　　我们证明，在编码突变 RAS 但野生型 RAF 的细胞中，达拉非尼（dabrafenib）可以以 CRAF 依赖性方式提高 pMEK 和 pERK，并且这些细胞也依赖于 MAPK 途径的生长（对 MEK 抑制敏感）。微信扫描下方二维码了解更多：