为了确认通过ENU诱变筛选鉴定的化合物ALK突变赋予劳拉替尼（Lorlatinib）抗性，研究独立生成了表达三种已鉴定化合物突变的Ba/F3细胞系-ALK G1202R/L1196M，ALK G1202R/L1198F和ALKL1196M/L1198F。用克唑替尼、色瑞替尼、阿瑞替尼、brigatinib或劳拉替尼处理细胞，48小时后测定细胞活力。与ALKG1202R或L1196M单突变体相比，化合物ALKG1202R/L1196M突变体对劳拉替尼（IC50G1202R或L1196M分别为1，116 nM与37或18 nM).ALK G1202R/L1196M双突变体还对所有测试的第一代和第二代ALK抑制剂均具有耐药性.相比之下，含ALKL1198F的化合物突变体对劳拉替尼和第二代ALK抑制剂耐药，但对克唑替尼表现出敏感性，如前所述。对于所有这些研究，使用EML4-ALK的变体1或变体3获得了相似的结果。
劳拉替尼（Lorlatinib）耐药化合物ALK突变的体外功能情况
接下来， 通过检查用劳拉替尼处理的不同Ba/F3模型中的ALK磷酸化来评估化合物ALK突变体的生化抑制。与细胞活力测定的结果一致，劳拉替尼处理抑制了非突变型ALK和单个ALK突变体的ALK磷酸化，但未能抑制ALK G1202R/L1196M、ALK G1202R/L1198F和ALK L1196M/L1198F复合突变体。因此，通过ENU诱变筛选鉴定的化合物ALK突变体在劳拉替尼存在下维持ALK活化。
为了验证在Ba/F3细胞中的发现， 设计了敏感的EML4-ALK v1肺癌细胞系H3122，以过表达EML4-ALK G1202R/L1196M。与Ba/F3数据一致，与过表达ALK G1202R的H3122细胞相比，过表达ALK G1202R/L1196M的H3122细胞对劳拉替尼具有高度耐药性（IC50分别为2，253 nM和46 nM）。此外，劳拉替尼治疗未能抑制化合物ALK突变体的ALK磷酸化，但能够抑制非突变体和单个ALK G1202R突变H3122细胞的ALK磷酸化.
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