特罗凯/厄洛替尼处理的成纤维细胞中的差异基因表达

　　靶向表皮生长因子受体 (EGFR) 的治疗会导致疼痛性皮疹，这是接受 EGFR 酪氨酸激酶抑制剂 (TKI) 治疗的非小细胞肺癌 (NSCLC) 患者中常见和使人衰弱的毒性；然而，预测皮疹的发展和严重程度是困难的。为了检查特罗凯/厄洛替尼（一种 NSCLC 患者用来阻止或减缓肿瘤生长的 EGFR TKI）如何改变真皮成纤维细胞的转录组。

　　方法：

　　真皮成纤维细胞 (ATCC® PCS-201-012™) 接种在细胞培养瓶中，在标准条件下生长，然后转移到细胞培养皿中。细胞每天用厄洛替尼 100nM (n= 5)、厄洛替尼 1μM (n= 5)、载体 1μM (DMSO) (n= 5)处理一次，持续三天，或不处理 (n= 5)。使用标准 TRIzol® 方法提取总 RNA，并使用 Affymetrix GeneChip® Human Genome U133 Plus 2.0 阵列进行杂交。使用稳健多阵列平均法对阵列产生的原始强度进行归一化，并使用 Limma R 软件中的方差分析进行分析。使用 Ingenuity Pathway Analysis 分析差异表达的基因，以确定该数据集中丰富的经典或非经典信号通路。

　　结果：

　　我们根据基因在伤口愈合 (AQP3)、皮疹发展 (CCL2)、成纤维细胞活化 (PALLD)、癌症和癌症进展 (GDF-15、SLC7A11、MMP12、DIRAS3) 和细胞周期控制中的潜在作用选择了基因进行研究（CDC6)。我们能够通过蛋白质印迹分析和 qPCR 验证其中的四个基因（MMP12、CCL2、CDC6和SLC7A11）。

　　如果在使用患者样本的未来研究中发现可以预测皮疹，我们的研究结果可能有助于识别有严重皮疹风险的患者，以便 可以调整 EGFR TKI 治疗的剂量；可以开发针对皮疹的其他治疗方法；或可以开发精确的、以患者为中心的干预措施，以便癌症患者可以更好地自我管理皮疹并坚持特罗凯/厄洛替尼治疗。

　　已证明靶向 EGFR 的疗法对过度表达 EGFR 的肿瘤（例如非小细胞肺癌）患者在临床上有效，但 EGFR TKI 疗法通常会导致疼痛的丘疹脓疱性皮疹，这可能会限制长期治疗。我们进行了这项微阵列研究，以进一步了解引入厄洛替尼治疗后成纤维细胞系中转录组的变化，并确定与 EGFR TKI 相关皮疹机械相关的潜在基因以供进一步研究。在我们选择用于验证的八个基因中，我们能够通过蛋白质印迹分析和 qPCR 确认四个基因（MMP12、CCL2、CDC6和SLC7A11）。

　　在这个实验中使用微阵列技术的优势是有机会在用特罗凯/厄洛替尼处理的真皮成纤维细胞中观察人类基因组中几乎所有基因表达的同时变化，对比联合对照（载体或不治疗）。然而，微阵列缺乏特异性，因为只能检查阵列上的基因。因此，我们感兴趣的基因可能存在不同的亚型，但在阵列上没有检测到。此外，杂交的背景水平（无论表达水平如何与探针杂交的基因）也限制了微阵列分析的准确性，尤其是对于低丰度的基因。鉴于此，我们无法验证也就不足为奇了AQP3和PARLD;尽管如此，我们的结果为在经历 EGFR TKI 诱导的皮疹的癌症患者中进一步研究这些基因提供了基础。

　　我们选择了几个基因进行进一步研究，因为它们在伤口愈合、皮疹发展或成纤维细胞活化中的潜在作用，但这些基因在我们的数据集中没有高度表达。CCL2已被证明在人类皮肤和不同小鼠模型中显着上调，表明 EGFR TKI 在皮肤中具有抗炎作用。在我们的微阵列研究中，在成纤维细胞系上用 1μM 厄洛替尼治疗导致CCL2下调，但在新实验中用 qPCR 证实时上调，这与所描述的研究一致。鉴于在所有皮肤细胞类型中都发现了免疫反应性，但在角质形成细胞中更为突出，CCL2在真皮成纤维细胞中的含量可能较低是合理的。在检查蛋白质的潜在关联时，字符串分析显示 CCL2 和 CDC6 之间存在某种关联，CDC6 是 DNA 复制早期步骤的调节剂。CDC6与 NSCLC 的鳞状亚型有关（Qian 等人，2014 年），并且与 NSCLC 患者的总体、无复发和无病生存期相关，与治疗和疾病分期无关。基因之间的关系及其与 EGFR TKI 诱导的皮疹的相互作用仍然是一个探索领域。

　　我们进行了一项微阵列研究，以了解特罗凯/厄洛替尼处理的成纤维细胞中转录组的变化。我们验证了四种基因表达的变化，CCL2、CDC6、SLC7A11和MMP12，并且它们是进一步研究的候选者，因为它们在真皮成纤维细胞中 EGFR TKI 相关皮疹的发展和严重程度方面具有潜在作用。如果在使用患者成纤维细胞样本的未来研究中发现可以预测皮疹，我们的研究结果可能有助于识别那些有严重皮疹风险的人，以便可以调整 EGFR TKI 治疗的剂量；可以开发针对皮疹的其他治疗方法；或可以开发精确的、以患者为中心的干预措施，以便癌症患者可以更好地自我管理皮疹并坚持 EGFR TKI 治疗。微信扫描下方二维码了解更多：