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奥希替尼强烈地降低了细胞生长

时间:2020-09-30 14:18 来源:奥希替尼强烈地降低了细胞生长 作者:康安途海外就医

  奥希替尼增加了egfr突变的NSCLC细胞系细胞表面HER-2的表达。

  我们首先评估了奥希替尼对PC9(e776-a750缺失)和PC9-T790M(e776-a750缺失和T790M突变,本实验室产生)细胞系中总EGFR和HER-2蛋白水平的影响。两种细胞系对药物均非常敏感,PC9和PC9-t790m的IC50分别为14.4±2.3和7.6±0.5nM。

  奥希替尼仅在PC9中诱导EGFR蛋白的总表达略有增加;相比之下,在PC9和PC9-t790m细胞中,HER-2蛋白表达均显著增加。流式细胞仪测定的质膜上EGFR水平,在使用奥希替尼治疗后没有显著上调(未显示)。相比之下,奥希替尼增强了PC9和PC9-t790m细胞HER-2的细胞膜表达,其作用剂量为-1b。

  奥希替尼和T-DM1联合治疗对细胞生长、细胞死亡、信号转导及抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)的影响。

奥希替尼

  在上述分析的基础上,为了检验奥希替尼联合曲妥珠单抗或曲妥珠单抗emtansine(T-DM1)治疗PC9和PC9-t790m细胞的疗效,我们首先评估单独使用曲妥珠单抗和T-DM1对细胞生长的影响。曲妥珠单抗无效,而T-DM1表现出抗增殖作用,PC9的IC50约为5°g/ml,PC9-t790m的IC50约为2.5°g/ml。相对于PC9,PC9-t790m对T-DM1的敏感性更高,可能与HER-2的基础高表达有关。

  然后我们研究了奥希替尼与T-DM1的相关性。在两种细胞模型中均观察到对细胞增殖的加性抑制作用(方法部分所述的Bliss相互作用模型评估)。此外,与单一治疗相比,联合用药提高了细胞死亡百分比。PC9和PC9-t790m细胞形成三维球状体,奥希替尼显著降低了细胞体积。T-DM1不抑制球形生长,但在两种细胞模型中,奥希替尼与T-DM1联合治疗相比奥希替尼单独治疗显著降低了3D生长。

  EGFR和HER-2磷酸化以及MAPK和AKT信号转导通路如预期的那样被奥希替尼有效抑制,因为这些模型对奥希替尼非常敏感;仅在PC9-T790M中,T-DM1在6小时内诱导HER-2磷酸化水平升高。然而,在两种细胞系中,奥希替尼和T-DM1联合使用与单独使用奥希替尼没有区别。我们还研究了奥希替尼暴露是否增强了激活NK介导的ADCC的能力。在il-2活化的NK细胞存在下,奥希替尼预处理的PC9-T790M细胞中,T-DM1依赖的细胞毒性显著增强,提示该药物可能提高T-DM1在体内的疗效。

  奥希替尼和T-DM1不同组合时序对细胞生长、细胞死亡和获得奥希替尼耐药的影响

  然后,我们在PC9和PC9-t790m的72h+72h实验中探索了使用不同给药方案联合使用奥希替尼和T-DM1的治疗潜力。用以下方法处理细胞:仅使用奥希替尼(O)或T-dm1(T)处理细胞;奥希替尼处理细胞72小时,奥希替尼+T-dm1处理细胞72小时(O→O+T);奥希替尼和T-dm1分别处理72h和72h(O→T);奥希替尼+T-dm1处理细胞72h,奥希替尼单独处理细胞72h(O+T→O)。正如预期的那样,奥希替尼强烈地降低了细胞生长,但是在短期生长实验中,当联合治疗是两种细胞模型的第一次治疗时,观察到抑制作用最大。

  相比之下,“奥希替尼插入T-dm1”(O→T)方案中检测到大量细胞,显示了奥希替尼对T-dm1疗效的拮抗作用。的确,在PC9和PC9-t790m中,奥希替尼的预处理显著降低了对T-DM1的敏感性,增加了IC50值在10°g/ml以上。我们还评估了细胞周期分布和细胞死亡。当PC9和PC9-t790m细胞暴露于T-DM148小时,观察到G2/M期阻滞。

  相比之下,在T-DM1处理前用奥希替尼处理细胞72小时,观察到细胞周期变化与周期对照组细胞相似。此外,在细胞预处理奥希替尼然后对待T-DM148h细胞死亡是对细胞治疗显著降低48h仅与T-DM1和一个上调抗凋亡蛋白mcl1和下调奥希替尼-pretreatedpro-apoptoticBim观察蛋白质的细胞暴露48hTDM-1而只有治疗48hT-DM1。

  这些结果表明,考虑到对细胞增殖和细胞死亡的拮抗作用,不建议采用奥希替尼作为第一种治疗方案,而抗体-化疗药物结合作为第二种治疗方案。

  然后,我们在一项长期生长试验中探索了使用不同给药时间组合奥希替尼和T-DM1的治疗潜力。在该试验中,将PC9-T790M细胞以低密度接种在96孔板中,用不同的时间进行处理,直到出现耐药克隆。时间表A(control,ctrl);方案B(连续使用奥希替尼处理的细胞)、方案C(连续使用奥希替尼处理的细胞,以及每7天周期同时使用T-DM1处理的细胞);表D(奥希替尼处理细胞,每7天插入T-DM1);表E(奥希替尼+T-DM1处理的细胞,每7天插入奥希替尼单独处理)。

  5周后,我们在B表中检测到一个二孔内细胞数量超过20个的菌落(2.1%),7周后,菌落数量略有增加,达到6个菌落(6.2%)。在C和E阶段观察到最大的菌落形成抑制,实际上,整个实验期间没有菌落出现。不同的是,在D时间表中,4周后出现了10个抗性菌落(9.6%),7周后出现了29/96个抗性菌落(30.2%)。

  考虑到很难从PC9-T790M细胞中获得耐药克隆,为了加强我们的结果,我们用对奥希替尼不太敏感的T790M突变体H1975细胞株(IC50for奥希替尼100nM)重复了部分实验。

  在H1975细胞中,通过流式细胞术检测,奥希替尼增加了HER-2蛋白的表达。奥希替尼协会的影响与T-DM1(IC50T-DM1:5μg/ml)当时评估对细胞增殖的抑制作用和添加剂是记录与相应的比例显著增加细胞死亡,确认的结果PC9PC9-T790M细胞。

  与预期的一样,我们在更短的时间内获得了更高比例的抗PC9-T790M细胞,许多孔达到了合流。特别是,连续使用奥希替尼可诱导完全耐药,4周后100%的井(96/96)汇合;T-DM1联合奥希替尼并插入单独的奥希替尼(方案C和E),7周后在汇合井中小于50%的奥希替尼耐药性的形成被延迟和降低。相比之下,同样在H1975细胞中,D抑制菌落形成的效果较差,仅延迟15天达到100%的融合。

  T-DM1克服HER-2过表达引起的奥希替尼耐药。

  据最近报道,HER-2扩增代表了患者对奥希替尼的耐药机制。基于这一临床结果,我们检测了奥希替尼对HER-2过表达PC9/HER2c1细胞的影响。HER-2过表达显著降低了对奥希替尼的敏感性,证实了之前的结果。然后我们测试了奥希替尼和T-DM1在这个克隆中的效果。将实验组合点与Bliss准则所期望的结果进行比较,发现了一种加性效应。

  单独或联合使用奥希替尼或TDM-1处理的PC9/HER2c1细胞的Westernblot分析表明,联合使用奥希替尼或TDM-1处理的PC9/HER2c1细胞在抑制HER-2磷酸化和活化AKT和MAPK通路方面最有效。

  为了进一步研究T-DM1是否能够克服HER-2扩增引起的对奥希替尼的内在抗性,我们进行了体内实验。将PC9/HER2c1细胞皮下注射到BALB/c裸雌性小鼠的侧翼,当肿瘤达到平均约200mm3时,随机分配给对照组(vehicle,ctrl)、奥希替尼、T-DM1或联合治疗。奥希替尼的给药剂量为10mg/Kg,根据先前的研究,这个剂量能够在pc9衍生的异种移植模型中诱导完全应答。与之前报道的一样,T-DM1的给药剂量为15mg/Kg。

  在两周内,每三到四天对肿瘤生长进行一次监测,在此期间,小鼠没有表现出毒性或其他异常行为的迹象,体重有规律地增加。奥希替尼抑制肿瘤生长6天,肿瘤生长为对照,显示奥希替尼耐药;T-DM1显著降低肿瘤生长,但与单药相比,奥希替尼联合T-DM1完全抑制肿瘤生长。与对照组相比,牺牲时切除的肿瘤体积减小,很好地证明了联合治疗的效果。奥希替尼哪里购买?在一般的药店可以买得到吗?详情请扫码咨询:

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(责任编辑:康安途海外就医)

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