多个研究分析了一二代EGFR抑制剂耐药后用奥希替尼9291治疗患者的耐药情况。结果显示：奥希替尼的耐药机制很少依赖EGFR途径，仅15%~32%的患者为EGFR途径依赖的三次EGFR突变，并最常发生在EGFR C797位点，即奥希替尼与EGFR的结合位点。
其他三次EGFR 突变为G724、L792、L718和G719，这些位点似乎阻碍了奥希替尼与EGFR的结合，而导致耐药。二线奥希替尼的耐药机制多由脱靶机制介导，与HER受体酪氨酸激酶家族密切相关，包括MET扩增(激活下游HER3)(6%~26%)、EGFR(0%~36%)和HER2(0%~8%)。
有趣的是，还发现了其他奥希替尼9291的获得性耐药机制，例如ALK融合、BRAF V600E突变、HER2插入、KRAS突变、NTRK融合、FGFR融合、RET融合和MET外显子14突变。
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