丙肝病毒是一种单股正链RNA病毒。病毒在肝细胞复制时，先要以母体病毒的正链RNA为模板，在NS5B聚合酶作用下，复制出互补的负链病毒RNA，然后再以负链RNA为模板复制出大量子代病毒RNA。在这一过程中，NS5B聚合酶是其中所必需的关键酶，而且人类细胞中没有近似功能的酶，没有NS5B聚合酶的参与丙肝病毒则无法复制。索磷布韦就是一种核苷类NS5B聚合酶抑制剂。
索磷布韦吸收后在肝脏内先代谢成三磷酸尿嘧啶类似物(尿苷三磷酸类似物)，三磷酸尿嘧啶类似物可以掺入到HCV RNA链中，“假扮”成病毒复制时需要的核苷三磷酸，“掺合”到新生病毒RNA链中，与丙肝病毒复制所需的NS5B聚合酶发生竞争性结合，用假“核苷”代替了病毒复制所需的真“核苷”，形成错误的病毒RNA模板，导致病毒RNA链的延长提前中止，丙肝病毒复制也因此被终止。
索磷布韦对所有基因型的丙肝病毒都有抑制作用，因此被医生称为“泛基因型”抗丙肝病毒药。它可以与利巴韦林联合，治疗基因2型丙肝病毒感染；还可以与蛋白酶抑制剂西米普韦联合，治疗基因1型4型丙肝病毒感染；索磷布韦与NS5A抑制剂(达拉他韦、雷迪帕韦或维帕他韦)联合，可以治疗所有基因型的丙肝病毒感染。索磷布韦与蛋白酶抑制剂和NS5A抑制剂不同，病毒对它不容易产生耐药性；即使产生了耐药性，停药后耐药病毒很快消失，可以更换另一种药物联合，再次用索磷布韦对以前治疗失败的患者进行再治疗。因此被医生称为“耐药屏障较高”的药物。
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